Introducción La región mixteca se ubica al sur de la República Mexicana, cubriendo parte de los estados de Puebla, Guerrero y Oaxaca, con una superficie total de 37 869 km2 . Una de las principales actividades económicas es la cría de ganado caprino bajo el sistema de libre pastoreo (Franco et al., 2008), cuya alimentación depende de la producción de plantas leñosas bien adaptadas a las condiciones edafoclimáticas del lugar (Hernández, 2006). Sin embargo, la mayor limitante de estos sistemas extensivos es la baja disponibilidad de forrajes en la época de sequía, debido a que la vegetación disminuye drásticamente y, en consecuencia, los rebaños caprinos enfrentan problemas de falta de alimento, siendo la única fuente alimenticia los rebrotes de plantas tóxicas, como el cazahuate (Arroyo, 2007). La intoxicación en los caprinos es ocasionada por sustancias conocidas como factores antinutricionales (FAN) o metabolitos secundarios que interfieren en el aprovechamiento de diversos nutrientes (proteínas, carbohidratos, minerales, etcétera). Esta intoxicación puede variar considerablemente en función del tipo de metabolito secundario, la estructura, la concentración, la solubilidad, el peso molecular y la cantidad consumida por el animal (Poncet-Legrand et al., 2006). Algunas propiedades químicas notables de los metabolitos secundarios son: el poder reductor derivado de su capacidad de absorber oxígeno (Chyau et al., 2002), su actividad antioxidante (Malencic et al., 2008), la excelente capacidad como agente quelante (SantosBuelga y Scalbert, 2000) y la capacidad de formar complejos estables con las proteínas y con otros polisacáridos, dependiendo del grado de polimerización y peso molecular (Hofmann et al., 2006). Estos factores antinutricionales (FAN) son sustancias naturales no fibrosas generadas por el metabolismo secundario de las plantas, mismas que utilizan como medio de defensa contra depredadores (Kumar y Singh, 1992). Particularmente en la mixteca baja de Oaxaca la principal alternativa de alimento para los rebaños caprinos durante la época de sequía son dos especies de plantas conocidas comúnmente como cazahuate blanco y negro. Durante tres años consecutivos se observaron en la región de estudio diferentes rebaños caprinos en el sistema de libre pastoreo en la estación más crítica (invierno-primavera), observándose que después de un consumo continuo de cazahuate blanco y negro
durante 20 días, los caprinos presentaron descoordinación, caída del tren posterior, temblores musculares, movimientos opistótonos, abortos, etcétera. Esta signología se presentó al consumir ambas especies; sin embargo, los productores de diferentes zonas de la mixteca baja difieren en cuanto a la toxicidad de la planta, mencionando que el cazahuate negro es más tóxico y otros afirman que es el blanco. Este desconocimiento sobre las distintas plantas tóxicas que se encuentran en la zona provoca que muchos casos de intoxicación queden sin diagnosticar o sean confundidos con otras causas. La identificación taxonómica de las plantas y un estudio fitoquímico permitirá determinar la presencia de los metabolitos secundarios y con ello llevar a cabo el diseño y la aplicación de medidas preventivas. Por tanto, el objetivo de la presente investigación se basó en estudiar la región de estudio a través de un análisis de suelo, colecta e identificación botánica de las plantas, análisis bromatológico y determinación preliminar de los metabolitos secundarios presentes en las dos especies de cazahuate. Materiales y Métodos Descripción de la región La región mixteca cubre áreas de los estados de Puebla, Guerrero y gran parte de Oaxaca. Esta región se encuentra clasificada como de alta marginación, con una población mayoritariamente indígena y con carencias de alimentación, educación (analfabetismo), vivienda y atención médica, entre otros. Dentro de las principales actividades económicas de la región se encuentra la producción de artesanías (por ejemplo el tejido de la palma) y de granos básicos en temporal, así como la caprinocultura (DIGEPO, 2010). La mixteca oaxaqueña se divide en alta y baja, integrada en su totalidad por siete distritos. El de Huajuapan está conformado por 28 municipios, con una población total de 118 534 habitantes, de los cuales 18% son analfabetos; veinte municipios tienen un alto grado de marginación. El estudio se llevó a cabo en el municipio de San Miguel Amatitlán (municipio de alta marginación), específicamente en la comunidad de San Jorge el Zapote, ubicado a 17° 54’ 49’’ N y 97° 59’ 47’’ O, a una altura de 1460 m. El clima es cálido subhúmedo con lluvias en verano, la precipitación promedio anual es de 450 a 600 mm y latemperatura media anual es de 21 °C, con medias máximas y mínimas anuales de 26 y 16 °C. Limita al norte con el estado de Puebla; al sur, con Huajuapan de León; al oriente, con Santiago Ayuquililla; y al poniente, con Fresnillo de Trujano y Mariscala de Juárez. Su distancia aproximada a la capital del Estado es de 241 kilómetros (DIGEPO, 2010). La superficie total del municipio es de 198.48 km2 y representa 0.20_% en relación con la superficie del Estado. Los tipos de vegetación reconocidos son seis: bosque de Juniperus, bosque de Quercus, bosque tropical caducifolio, matorral xerófilo, matorral subtropical y bosque de galería, predominando huizache (Acacia farneciana), tehuistle (Acacia picachensis),cubata (Acacia cochliacantha), mezquite (Prosopis la evigata), huaje (Leucaena esculenta), cazahuate (Ipomoea Spp.), hierba de burro (Ambrosia chenopodiifolia, tlaxiztle (Amelanchier denticulata), ocotes (Pinus montezumae), encinos (Quercus glaucoides), entre otros. La fauna silvestre es muy escasa debido a la enorme deforestación y a la cacería; sin embargo, aún prevalecen algunos animales, como conejos (oryctolagus cuniculus), mapaches (procyon), zorros (vulpes vulpes), armadillos (Dasypus novemcinctus), tlacuaches (Chironectes, minimus) tejones (Meles meles) y venados (Odocoileus virginianus); aves como gavilán (Accipiter nisum), codornices (Coturnix corturnix), zopilote (Cathartes aura), palomas (Columba livia), colibrí (Archilochus colubris), calandrias (Mimus saturninus), chachalacas (Ortalis vetula) y correcaminos (Geococcyx calfornianus). Entre los reptiles están lagartijas (Podaris sp.), iguanas (Conolophus subcristatus) y serpientes (Crotalus). Dentro de las principales actividades económicas del municipio se encuentra la agricultura (maíz, frijol y calabaza), ganadería (caprinocultura) y comercio. Los suelos dominantes son regosol (81.79 %), leptosol (12.33 %) y phaeozem (5.88 %). En cuanto al uso potencial de la tierra 3.43 % es para agricultura manual estacional y 96.57 % no es apta para la agricultura. En el aspecto pecuario, 96.57 % de la vegetación natural es aprovechada únicamente por el ganado caprino (INEGI, 2005). Análisis de suelo Los tipos de suelo presentes en esta región son los litosoles, regosol, éutrico, regosol calcáreo, feozem háplico y cambisol cálcico. Los litosoles son los que mayor área ocupan, con una profundidad menor a los10 cm; son pedregosos y la roca madre comúnmente aflora. En ellos crecen principalmente el matorral xerófilo y en menor proporción el bosque de Juniperus y el matorral subtropical. Con estas condiciones la supervivencia de diferentes especies vegetales en temporada de sequía es muy difícil; es por ello que las especies que rebrotan en las primeras lluvias (como el cazahuate blanco y negro) buscan su supervivencia, produciendo metabolitos secundarios como medio de defensa. Las plantas generan los compuestos secundarios y los concentran en sus diferentes tejidos vegetales de acuerdo con una estrategia de defensa, esto en función de la importancia del tejido para la planta en ese estado fisiológico (Harborne, 1999). Dalo y Moussatché (1998) destacan que la toxicidad de los vegetales depende de muchas variables relacionadas con la planta, tales como la especie vegetal, el estado vegetativo, la época del año y las condiciones climáticas y edáficas, etcétera. Para realizar el análisis de suelo, en mayo de 2011 se tomaron diferentes muestras de suelo en la comunidad de San Jorge el Zapote, municipio de San Miguel Amatitlán, específicamente en los lugares donde se realizó la colecta de hojas de las dos especies en estudio. Las muestras de suelos se tomaron de 15 cm de profundidad, depositándolas en bolsas de plástico (impermeables por dentro), previamente identificadas para su traslado al Laboratorio de Fertilidad y Química Ambiental del Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, identificadas con el Lote N. 2012014/ 737-738. En el laboratorio se determinó el pH (Black, 1968); Conductividad Eléctrica (C.E) (Jackson et al., 1982); Materia Orgánica (M.O) (Klra y Maynard, 1991); Fósforo (P) (Olsen y Dean, 1965 y John, 1970); Calcio (Ca), Magnesio (Mg), Sodio (Na) (Champman, 1965); Potasio (K), Carbono (C), Fierro (Fe), Cobre (Cu), Manganeso (Mn), Zinc (Zn) (Lindsay y Norvell, 1978); Nitrógeno (Bremer, 1965) y Textura por el método de Boyoucos (Gee yBawder, 1986 ). Recolecta de ejemplares botánicos En septiembre de 2011 se realizaron colectas de ejemplares botánicos (por triplicado) con diferentes partes vegetativas (raíz, tallo y hojas) y reproductoras (flor y fruto) de las dos especies de cazahuate; éstas fueron prensadas (prensa portátil de madera 60 x 40 cm) para su traslado al laboratorio del Programa de Botánica del Colegio de Postgraduados para su identificacióntaxonómica. Se tomó nota de la información obtenida al momento de la colecta, y con apoyo de un GPS (Global Position System) se registró la ubicación exacta del lugar. En el laboratorio se secó totalmente el material botánico colectado mediante una deshidratación y un aplanado, con el fin de preservar las estructuras de las plantas para su posterior identificación. Las muestras prensadas se colocaron entre dos hojas de papel secante (60 x 40 cm), previamente etiquetadas, poniendo en cada dos muestras un cartón acanalado, apilándose de la misma manera los demás ejemplares. Enseguida se procedió a sujetar la prensa, manteniéndola en el secador prefabricado por cinco días, tiempo suficiente para la deshidratación. El secado, identificación, montaje y etiquetado de los ejemplares botánicos fue realizado en el mismo herbario-hortorio del Programa de Botánica del Colegio de Postgraduados, donde fueron depositados, y los duplicados se distribuyeron en otros herbarios nacionales.
Estudio fitoquímico La presencia de metabolitos secundarios en los tejidos vegetales se detectó con el análisis de los extractos, mediante agentes cromógenos (sustancias que reaccionan formando precipitados, espuma y cambios de color, entre otros) (Raffauf, 1994) y cromatografía en capa fina (CCF), la cual permite analizar moléculas pequeñas, y de esta manera conocer el número de compuestos presentes en la muestra (Domínguez, 1988; Stahl, 1969). Mediante la realización de estas pruebas específicas se determinó de manera cualitativa la posible presencia o ausencia de diversos metabolitos secundarios (terpenoides, flavonoides, alcaloides, saponinas y taninos) en los cuatro extractos obtenidos de cada especie vegetal (cazahuate negro y blanco), determinándose a partir del nivel de coloración obtenida en la placa de CCF al ser aplicado el revelador específico para cada grupo de metabolitos, siguiendo la metodología descrita por Domínguez (1988), Stahl (1969); Soto y Rodríguez (1998). Para la valoración de las pruebas realizadas se utilizó el sistema cualitativo de cruces para especificar la presencia o ausencia de los grupos de metabolitos mediante los siguientes
criterios: Alto contenido o Presencia cuantiosa (+++), Presencia notable (++), Presencia leve (+) y Ausencia (-) (Galindo et al., 1989; García, 2003). Análisis estadístico Las diferencias de las medias en los análisis bromatológicos entre las dos especies se compararon con la prueba t de Student y los porcentajes de rendimientos de los extractos se hizo con la prueba de Kruskal-Wallis (S.A.S, 2002). Resultados Identificación botánica Las dos especies de plantas identificadas por técnicos y productores como causantes de intoxicación en cabras en la mixteca baja de Oaxaca en temporada de sequía, conocidas comúnmente como cazahuate blanco y cazahuate negro, fueron identificadas como I. murucoides (Roemer y Schuites, 1819) e I. pauciflora subsp. pauciflora (Martens. y Galeotti, 1845), respectivamente, pertenecientes a la familia Convolvuláceae. (Figura. 1). Ipomoea es el género que mejor representa a la familia Convolvuláceae, con cerca de 500 especies de distribución, de las cuales 150 se encuentran en México. Dentro de este género hay especies de hábito arbóreo-arbustivo o de enredaderas leñosas que se han diversificado (McDonald, 1992). Solano (1997) realizó un estudio florístico en la mixteca baja oaxaqueña, identificando la existencia de seis especies de Ipomoea, mencionando entre ellas a I. murucoides e I. pauciflora, sin hacer mención de la subsp pauciflora. Ipomoea murucoides es una planta originaria de México, crece en climas que van de semicálido a templado en alturas de los 600 a los 2400 m, asociada a bosque tropical caducifolio y a matorral xerófilo, siendo común encontrarla en matorrales secos y espinosos. Es un especie arbóreo-arbustiva de 3 a 10 m de altura, de madera blanda, con presencia de látex, con tallos floríferos longitudinalmente surcados, densamente lanuginosos de 5 a 8 mm de diámetro. Las hojas son alargadas, presenta grupos de flores blancas que son muy vistosas, los frutos son lisos y en forma de huevo (cuando se encuentran secos tienden a abrirse), las semillas están cubiertas con pelos blancos y suaves (Pherson, 1981).Ipomoea pauciflora es una planta cuyo origen aún se desconoce; sin embargo, habita en climas cálido y semicálido, entre 400 a 2000 msnm, asociada a la vegetación muy perturbada, derivada de bosque tropical caducifolio y matorral xerófilo. I.pauciflora es una planta arbóreo-arbustiva que llega a medir de 3 a 8 m, con flores de color blanco, y sus semillas están cubiertas por suaves pelos blancos (Soto, 1987)
Análisis de suelo Los resultados obtenidos en los diferentes parámetros (pH, CE, M.O., N, P, K, Ca, Mg, Na, Fe, Cu, Mn, Zn) y la textura (arena, limo, arcilla) evaluados del suelo mostraron ser similares en ambas especies de Ipomoea (Cuadro1), descartando con ello alguna diferencia en la composición del suelo que repercuta en el crecimiento o producción de metabolitos secundarios de las especies en estudio, tomando en cuenta que las muestras de suelo se tomaron alrededor de cada especie vegetal. Es importante mencionar que las exigencias edafoclimáticas de diferentes especies del mismo género no son las mismas; tal es el caso de Ipomoea fistulosa (Mart.ex Choisy), la cual requiere de zonas parcialmente inundables o húmedas (Hueza et al, 2003); sin embargo, Ipomoea carnea, I. conzzati (Greenman), I. elongata (Choysi), I.orisabensis (Ledonois ex Standley) e I. purpurea (L.Roth) requieren lugares secos con condiciones similares a las especies de este estudio para su crecimiento (I.pauciflora e I. murucoides). Análisis bromatológico Las hojas de las plantas evaluadas en este estudio mostraron diferencia en la mayoría de fracciones en su composición química (proteína cruda, extracto etéreo, fibra detergente acida (FDA), fibra detergente neutra (FDN) y celulosa), excepto en lignina (Cuadro2). Los valores de proteína cruda (determinando el contenido total de nitrógeno total por 6.25) tuvieron diferencias significativas (P<0.002) entre las dos especies evaluadas: 18.67 % para I. murucoides y 18.19% para I. pauciflora. Estos valores son muy similares a las de otras especies existentes en la mixteca en temporada de lluvia; tal es el caso del huamúchil, con un contenido de proteína cruda de 18.3 % (Hernández et al., 2002). Devendrá (1995) y Hernández (2006) mencionan que el valor nutricional de las plantas depende del estado fenológico, época del año, topografía, clima, madurez vegetal, fertilización; así como la posición de las hojas en las ramas. Las hojas evaluadas en este estudio son rebrotes de las dos especies de Ipomoea, ya que en esta etapa las cabras las consumen como única alternativa de alimentación en temporada de sequía. Los contenidos de FDN, FDA y cenizas en Ipomoea murucoidesreflejan mayor madurez de la planta en comparación con I. pauciflora en la misma región y tiempo de colección. En consecuencia, estos resultados generan menor digestibilidad y disponibilidad de energía en el forraje. En referencia al extracto etéreo, el mayor valor lo presentó Ipomoea murucoides. En general, a pesar de crecer en una temporada crítica y difícil (sequía), estas plantas presentaron un contenido nutricional aceptable, a diferencia de otras especies vegetales reportadas en la literatura (Tobin y Muller, 1998). Sin embargo, la presencia de compuestos secundarios en las plantas con actividad antinutricional influye en el valor nutritivo del follaje. Poppi y Norton (1995) los consideran como la mayor limitante para incrementar el uso de las leguminosas tropicales en la nutrición animal. Obtención y rendimiento de los extractos a partir del material vegetal Los rendimientos de los extractos obtenidos de las dos especies de Ipomoea mostraron mayor porcentaje de rendimiento en el extracto con metanol (20.2 y 12.9 %), posteriormente el de agua (10.2 y 5.9 %), seguido del hexano (7.9 y 5.5 %) y el diclorometano (1.8 %), siendo I.murucoides la que presentó mayor rendimiento a excepción del extracto con diclorometano, lo cual fue similar en ambas especies (Cuadro 3). A partir de los resultados obtenidos se demuestra que las hojas de estas especies contienen más compuestos polares (solubles en metanol y agua) que de baja polaridad (hexano y diclorometano). Estos rendimientos fueron obtenidos a partir del material seco y se obtuvieron por diferencia de peso con el extracto. Un estudio similar realizado en Venezuela con Ipomoea quamoclit (Convolvulaceae), realizando extracciones con hexano y metanol de hojas, flor y tallo, obtuvieron mayor rendimiento del extracto con metanol (Shailili et al, 2007), similar a lo registrado en el presente estudio con las dos especies de Ipomoea. Estudio fitoquímico En los extractos crudos de las dos especies de Ipomoea, procedentes de la parte foliar de las dos especies de Ipomoea, se encontró un alto contenido (+++) de flavonoides y taninos (extracto con metanol), una presencia notable (++) de alcaloides libre y liberados (extracto con diclorometano) y la presencia notables de (++) terpenoides (extracto con hexano y diclorometano) Sin embargo, en el extracto con agua hubo presencia leve (+) de taninos en I. murucoides y en I. pauciflora (-) hubo ausencia. En ninguno de los extractos de las dos especies se encontró la presencia de saponinas (Cuadro 4, Figura. 2). La presencia cualitativa de estos metabolitos secundarios fue muy similar en las dos especies, observándose muy poca diferencia en la cromatografía de capa fina (CCF) realizada. Estas pequeñas variaciones se atribuyen tanto a las especies, al estado de desarrollo como al estado fisiológico de la planta, los cuales cumplen un papel importante como mecanismos de señalización y defensa ante las agresiones ambientales (estrés abiótico, cantidad de luz, agua, cambios extremos de temperatura, heridas, así como otras provenientes de los organismos patógenos o de herbívoros). Los resultados para alcaloides coinciden
con lo reportado por Jenett - Siems et al. (2004) sobre la presencia de este tipo de compuestos en ocho especies de Ipomoea, todas provenientes de Alemania. Sin embargo, estos estudios no han demostrado aún la presencia de flavonoides y taninos. Por otro lado, dos estudios sobre el género Ipomoea, especie carnea, uno realizado en Argentina y otro en Mozambique, señalan que es una planta toxica, provocando pérdidas económicas en la producción animal cuando es consumida por las cabras en épocas de escasez de pasturas naturales, debido a que es una de las pocas especies que permanecen verdes todo el año, identificando la presencia de alcaloides “swainsonina y calisteginas” en esta planta mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (Katalin et al., 1999; Riet y Méndez, 2000). La signología clínica presentada por el consumo de esta especie (Ipomoea carnea)se caracteriza por movimientos oscilatorios laterales de la cabeza, nigmatismos oculares, ataxia, tremores, balanceo, caída del tren posterior, dificultad para levantarse, y paresia (Armién et al., 2007; Haraguchi et al., 2003). Otros signos observados al consumir Ipomoea carnea son: pérdida de peso, disminución de la frecuencia de ruidos ruminales, anemia, retardo en el tiempo de llenado capilar y anormalidades del pliegue cutáneo (Daló y Moussatché, 1998). Algunos animales muestran gran apetencia hacia el consumo de esta especie, lo cual posiblemente conduzca a una adicción (Barbosa et al., 2006; Ralphs et al.,1990). Ipomoea fistulosa es otra especie perteneciente a la familia Convolvuláceae en Argentina, donde en condiciones naturales, con oferta suficiente de alimento, los animales no ingieren estos vegetales. El consumo de esta Ipomoea ocurre en determinadas épocas del año, principalmente por la falta de forraje suficiente, siendo más afectados los animales jóvenes. Su toxicidad es atribuida a la presencia de alcaloides inhibidores de glucosidasas (swainsonina y calisteginas) (Méndez y Riet- Correa, 2000; Molyneux et al., 1995). Las cabras de la región mixteca baja de Oaxaca presentaron una signología similar, por lo que se asume que esto se debe al consumo de las especies I. murucoides e I. pauciflora, de las cuales no existe información científica. Conclusiones Las dos especies conocidas como cazahuate blanco y negro, señaladas como causantes de intoxicación en cabras en el periodo de sequía (invierno-primavera) en la región mixteca baja de Oaxaca, fueron especies identificadas como murucoides y pauciflora (subsp. pauciflora), pertenecientes al género Ipomoea de la familia Convolvulácea. El análisis bromatológico realizado en las dos especies mostró que tienen un porcentaje de proteína y extracto etéreo aceptable para la alimentación de los animales, a pesar de crecer en un suelo pobre. Sin embargo se encontró la presencia de metabolitos secundarios al realizar el análisis fitoquímico preliminar en ambas especies, identificando un alto contenido (+++) de taninos y flavonoides, y la presencia notable (++) de terpenoides y alcaloides libres y liberados. Con este estudio realizado se empieza a corroborar que son especies arbóreo-arbustivas necesarias en la alimentación de los rebaños (de sistema de explotación extensiva) en temporada de sequía; sin embargo, con base en lo obtenido enda A.O.A.C. 1975. Official Methods of Analysis of the Association of official Agricultural Chemists. 12th Edition. Published by the Association of official Agricultural Chemists. Washington,D.C. A.O.A.C. 2000. Official Methods of Analysis of the AOAC International, 17th Ed. 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